תַקצִיר
תאי עָצָב (נוֹיְרוֹנִים), הם תאי מוח שיכולים לייצג מידע ולאחסן אותו. הם גם מסייעים לגוף להגיב לאירועים שקורים סביבנו. כיצד תאי העצב מייצגים את המידע הזה, מעבדים אותו ומאחסנים אותו? אֵילוּ תאי עצב פעילים כשאנו מתנהגים בצורה מסוימת? אלה הן שאלות מדעיות בסיסיות. גישה ניסויית חשובה שמטרתה לענות על השאלות הללו, מבוססת על תיעוד פעילוּת תאי העצב בתוך המוח. בשנת 2001, מדענים פיתחו גישה שעושה שימוש באור, ובחלבון מרתק שמפיץ אור פְלוּאוֹרֶסְצֶנְטִי בוהק כאשר תאי העצב פעילים. החלבון המהונדס הזה, שנקרא ,GCaMP מגיב לכמויות הסידן שנמצאות בתוך תאי העצב, בהתבסס על כך שכאשר תא עצב נכנס לפעולה, כמויות הסידן שבו עולות. כיום, מעבדות רבות ברחבי העולם עושות שימוש בחלבון GCaMP במטרה לחקור את פעילות תאי העצב. במאמר זה נסביר כיצד הכלי הזה פועל, ומה הופך אותו שימושי כל כך בחֵקֶר המוח.
סידן זורם לתאי עצב כאשר הם נכנסים לפעולה
תאי עצב (נוירונים), הם תאי מוח שיכולים לאחסן מידע ולשדֵּר אותו, באמצעות אותות חשמליים וכימיים. תאי העצב 'מְדַבְּרִים' זה עם זה בעזרת כימיקלים המכונים מוליכים עצביים. כאשר תא עצב מופעל חשמלית, הוא יכול לשחרר מוליכים עצביים אשר נעים אל תאי העצב השכנים, ומשפיעים על פעילותם. האות החשמלי שֶׁמְּאַתְחֵל את התקשורת הזו נקרא דַּחַף עֲצַבִּי, והוא מקרה פרטי של תופעה פיזיולוגית המכונה 'פוטנציאל פעולה' (Action Potential), המתרחשת גם בסוגי תאים נוספים בצמחים ובבעלי חיים. הדחף העצבי הוא מרכיב חיוני בתקשורת בין תאי העצב. כאשר הוא נכנס לפעולה, הדחף העצבי נע לאורך תא העצב, וגורם לשחרור מוליכים עצביים לכיוון תא העצב הַשָּׁכֵן [1].
כמו כל תא אחר בגוף, תאי העצב מוקפים בשכבה המכונה 'קרום התא' (מֶמְבְּרָנָה), אשר מפרידה בין פְּנִים התא לבין מה שנמצא מחוץ לתא. שתי הסביבות – בתוך התא ומחוץ לו, נבדלוֹת בהרכּביהן הכימיים. ההבדל בין מִספר המִּטענים החשמליים בפנים התא לעומת מִספר המטענים החשמליים בסביבתו החיצונית, נקרא מֶתַח קרום התא. כאשר תא עצב נמצא במצב מנוחה (כלומר, אינו פעיל), הוא מכיל מעט מאוד סידן, ומתח קרום התא שלו קבוע (איור 1A). כאשר מתרחש דחף עצבי בתא עצב, מתח קרום התא עולה, ומאפשר לכמות עצומה של סידן לזרום אל תוך תא העצב. כאשר הסידן נכנס, הוא גורם לשחרור המוליכים העצביים, וכך מתאפשרת תקשורת בין תאי העצב.
- איור 1 - כאשר תא העצב נכנס לפעולה, כמות הסידן שבּו עולה.
- (A) כשתא העצב במצב מנוחה (Resting neuron), שערי הסידן סגורים (Calcium gates are closed), סידן אינו יכול להיכנס לתוך תא העצב (Calcium can not enter inside the neuron), וכמות הסידן בתא נמוכה מאוד. (B) כאשר תא העצב נכנס לפעולה (Active neuron), שערי הסידן נפתחים (Calcium gates are opened), סידן יכול להיכנס לתוך תא העצב (Calcium can enter inside the neuron), וכמות הסידן בתא עולה בחדוּת. מקרא:
Outside the neuron – מחוץ לתא העצב
Inside the neuron – בתוך תא העצב
מה יכול לאפשֵׁר את זרימת הסידן הפתאומית אל תוך תא העצב? התשובה לכך היא שעל פני קרום התא מפוזרים 'שערי סידן', שנפתחים ונסגרים כתלות במתח קרום התא. כך פועל התהליך: כאשר תא עצב נמצא במצב מנוחה, שערי הסידן סגורים, ויש מעט מאוד סידן בתוך התא (איור 1A). כאשר תא העצב נכנס לפעולה, מתח קרום התא שלו עולה, שערי הסידן נפתחים וסידן מציף את התא (איור 1B). ניתן להשתמש בעלייה המהירה הזו בכמות הסידן בתוך התא, כאות המוֹרֶה לנו אם תא העצב פעיל, או אם הוא אינו פעיל.
מהו חלבון פלוּאוֹרֶסְצֶנְטִי ירוק?
האם ניתן למדוד את ריכוז הסידן בתוך תא העצב במטרה לעקוב אַחַר פעילותו? כדי להבין כיצד ביכולתנו להדמוֹת את פעילוּת תאי העצב, עָלֵינו להציג מושג חשוב: פְלוּאוֹרֶסְצֶנְטִיוּת. כמו כן אנו צריכים ללמוד על אודות חלבון פלואורסצנטי מיוחד מאוד. פלואורסצנטיוּת [2] היא תופעה פיזיקלית המתרחשת כאשר מולקולה סופגת אור בצבע מסוים, וכמעט מייד פולטת אור בצבע אַחֵר. מולקולות פלואורסצנטיות סופגות ופולטות אור במגוון צבעים, כתלות בהרכּבן ובמבנה שלהן. צורותיהן של המולקולות הפלואורסצנטיוֹת מכריעוֹת, משום שהן מאפשרות את ספיגת האור ופליטתו.
עולם הטבע מלא בחלבונים. חלבונים הם מולקולות גדולות המיוצרות על ידי תאי הגוף במטרה לבצע תפקודים ייעודיים. תאים משתמשים בחלבונים כדי לכווץ שרירים, להגן עלינו מפני זיהומים, ולשנע חומרים בתוך התא ואל מחוץ לקרום התא. לדוגמה, גם שערי הסידן הם חלבונים, שתפקידם להיפתח ולהיסגר, כתלות במתח קרום התא. ישנם חלבונים שתפקודם הוא פלואורסצנטיות. אחד החלבונים הפלואורסצנטיים המפורסמים ביותר הוא חלבון הַפְלוּאוֹרֶסְצֶנְט הירוק (GFP). חלבון ה-GFP התגלה לראשונה בתוך מדוּזוֹת (איור 2A). מדענים גילו אותו כאשר חקרו את מקור האור הירוק שהמדוזה מפיצה [5–3]. חלבון ה-GFP סופג אור כחול או סגול, ופולט אור ירוק (איור 2B). בעקבות גילוי ה-GFP, מדענים רבים שיתפו פעולה במטרה להבין את המבנה הכימי של חלבון זה, כמו גם את הקוד הגנטי המאפשר למדוזה לייצר אותו.
- איור 2 - חלבון הפלואורסצנט הירוק (GFP).
- (A) חלבון ה-GFP התגלה לראשונה במדוזות (Jellyfish). (B) כאשר חלבון ה-GFP מקבל וסופג אור כחול, הוא פולט אור ירוק. (C) כאשר מכניסים לתא עצב את הקוד הגנטי של חלבון ה-GFP, תא העצב מייצר את החלבון הזה, וכתוצאה מכך מפיץ אור פלואורסצנטי. מקרא:
Blue light sent to the protein = אור כחול הנשלח לחלבון
Green light emitted from the protein = אור ירוק הנפלט מהחלבון
Green fluorescent neuron = תא עצב המייצר חלבון פלואורסצנט ירוק
הקוד הגנטי של חלבון מסוים הוא ה'מתכון' המשמש את התאים לייצור אותו חלבון. כאשר המדענים גילו את המבנה של חלבון ה-GFP ואת הקוד הגנטי שלו, הם שינו את הקוד, כך שתאים של אורגניזמים אחרים יוכלו אף הם לייצר את החלבון. זאת במטרה לסייע לחוקרים להבין תהליכים שונים המתרחשים בתוך התא, ולראות תהליכים אלו. כאשר תא מייצר GFP הוא הופך פלואורסצנטי, כלומר, כאשר מאירים אותו באור כחול, הוא פולט אור ירוק, וכך ניתן לזהות אותו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. תגלית חלבון ה-GFP הובילה למהפכה גדולה בתחום הביולוגיה, ושלושה מדענים שהיו מעורבים בתגלית זכו על כך בפרס נוֹבֶּל לכימיה לשנת 2008.1 כיום, מדענים יכולים להשתמש בחלבון ה-GFP כדי להפוך תאי עצב לפלואורסצנטיים, וכך לראות אותם בבירור באמצעות מיקרוסקופ (איור 2C). אולם כיצד אנו יכולים להשתמש בחלבון ה-GFP וברמות הסידן ככלים לקריאת פעילותם של תאי העצב?
כיצד מדענים משתמשים בפלואורסצנטיות להבנַת פעילוּת תאי העצב?
עד כה למדתם שכאשר תא עצב נכנס לפעולה, רמת הסידן בתוכו עולה. גיליתם גם כי יש חלבונים, כמו חלבון ה-GFP, שיכולים להיות מיוצרים בתוך תאי עצב, ולהופכם פלואורסצנטיים. כעת, נחקור כיצד חלבון מהונדס בשם GCaMP עושה שימוש בסידן ובפלואורסצנטיות כדי להדמוֹת פעילות של תאי עצב.
כאשר יצרו את חלבון ה-GCaMP, המטרה הייתה ליצור חלבון ש'יידלק' כאשר רמות הסידן בתא העצב עולות. כך, תכונת הפלואורסצנטיות 'תִּדָּלֵק' כשתא העצב פעיל, ו'תִּכְבֶּה' כשהוא במצב מנוחה. כדי לעשות זאת, נדרשו שלושה רכיבים: רכיב אחד שיכול לחוש את כמות הסידן בתא העצב, רכיב שני המייצר אור, ורכיב שלישי שמדליק את המערכת ומכבה אותה, כתלות בכמות הסידן. בעזרת שלושת הרכיבים הללו, המדענים יצרו מולקולה שהופכת פלואורסצנטית רק כאשר נקשר אליה סידן.
במטרה לבצע זאת, המדענים פיתחו סוג חדש של חלבון GFP שיכול לשנות את צורתו, שנקרא cp-GFP. האותיות 'cp' הן ראשי התיבות באנגלית של המילים תְּמוּרָה מעגלית (circular permutation). תהליך התמורה המעגלית גורם לחלבון לשנות את צורתו תחת תנאים מסוימים, במקרה זה, בתגובה לסידן. שינוי הצורה בחלבון ה-cp-GFP מתרחש הודות לשני חלקים אחרים, המחוברים ל-cp-GFP במיקומים מדויקים מאוד: יחידה 1 ויחידה 2. מכלול החלבון הזה נקרא GCaMP (איור 3A). כאשר אין נוכחות של סידן, יחידה 1 ויחידה 2 רחוקות זו מזו. המרחק בין שתי היחידוֹת מוֹנע מחלבוני ה-cp-GFP להיות פלואורסצנטיים. עם זה כאשר הסידן נקשר אל יחידה 2, יחידה 1 מתקרבת אליה לפתע ומשנה מעט את צורת החלבון, כך שהוא הופך פלואורסצנטי [6] (איור 3B). אפשר לתכנן תאי עצב של עכברים כך שייצרו חלבון GCaMP (איור 3C), מה שמאפשר למדענים להדמוֹת את פעילות תאי המוח של העכברים (איור 3D ו סרטון 1).
- איור 3 - חלבון GCaMP.
- (A) GCaMP הוא חלבון שנוצר מחיבור של cp-GFP עם שני חלקים נוספים, הנקראים יחידה 1 (unit 1) ויחידה 2 (unit 2). (B) חלבון ה-GCaMP אינו פלואורסצנטי (Non-fluorescent), אך כאשר הסידן נקשר ליחידה 2, יחידה 1 מתקרבת ליחידה 2 וגורמת לשינוי קל בצורת ה-cp-GFP. שינוי זה הופך את חלבון ה-cp-GFP לפלואורסצנטי (Fluorescent GCaMP). (C, D) GCaMP יכול להיות מיוצר בתאי עצב של בעלי חיים, וכך לגרום לתאים להפיץ אור כאשר התאים פעילים (סרטון 1). מדענים יכולים להתבונן בתאים הפלואורסצנטיים באמצעות מיקרוסקופ מיוחד, במטרה לענות על שאלות הנוגעות לתפקודו של המוח. Resting neuron Non-fluorescent – תא עצב במצב מנוחה, לא פלואורסצנטי Active neuron Fluorescent – תא עצב במצב פעולה, פלואורסצנטי
- סרטון 1 - נוירון המבטא GcaMP נעשה בהיר יותר ככל שקצב פעילותו גובר.
מדוע הכלי הזה חשוב?
זיכרון הוא תהליך מרתק. מאמצים רבים הושקעו במטרה להבין כיצד המוח מייצג מידע, מעבד אותו ומאחסן אותו. צפייה בפעילות של קבוצת תאי עצב לאורך זמן יכולה לסייע מאוד להבין כיצד פעילותם משתנה במסגרת תהליך הלמידה, או מָהֵם הכְּשלים בתפקודם של תאי עצב במחלות הקשורות למוח. לדוגמה, באחד המחקרים שלנו, בדקנו כיצד אוכלוסיות שונות של תאי עצב הגיבו בזמן שעכבר למד לבצע משימה מסוימת. זיהינו דפוסי פעילות מסוימים בתאי עצב הממוקמים באזור המוח שנקרא 'קליפת המוח הקדם-מצחית'. מידע זה סייע לנו להבין טוב יותר את תפקידיה של קליפת המוח הקדם-מצחית בתהליך הלמידה.
מאז תחילת השימוש בחלבון ה-GCaMP בשנת 2001, מדענים עמלו במטרה לשפר את חלבון חיישׁן-הסידן הזה, לגרום לו להפיץ יותר אור, וכן להגביר את רגישותו ואת עוצמתו. יצירת חלבון ה-GCaMP תרמה גם לפיתוח מיקרוסקופים פלואורסצנטיים משופרים, שיכולים להדמוֹת ביעילות תאי עצב המייצרים חלבון זה. לסיכום, חלבון ה-GCaMP הוא כלי עוצמתי המשמש מעבדות רבות ברחבי העולם. פיתוחו הוביל למהפכה ביכולתם של מדענים 'לְרַגֵּל' אַחַר הפעילויות המתרחשות במוח.
מימון
עבודה זו זכתה למימון מטעם המועצה האירופית למחקר (CoG 819496, PrefrontalMap).
מילון מונחים
תאי עצב (Neurons): ↑ תאי מוח המְּתקשרים זה עם זה באמצעות אותות חשמליים, ויכולים לשדֵּר מידע.
מוליכים עצביים (Neurotransmitters): ↑ מולקולות כימיות המאפשרות לתאי עצב לשדֵּר מידע לתאי עצב שכנים.
דחף עצבי (Action Potential): ↑ אות חשמלי המתרחש בתא עצב פעיל.
מתח קרום התא (Membrane Potential): ↑ ההבדל במִספר המִּטְענים החשמליים הקיימים בסביבתו הפנימית של התא לעומת סביבתו החיצונית.
פלואורסצנטיות (Fluorescence): ↑ תופעה המתרחשת כאשר מולקולה סופגת אור בצבע מסוים ופולטת אור בצבע אחר.
חלבון הפלואורסצנט הירוק Green Fluorescent Protein, (GFP): ↑ חלבון המיוצר בטבע על ידי מדוזות, אשר סופג אור כחול ופולט אור ירוק.
GCaMP: ↑ חלבון המבוסס על חלבון ה-GFP, שהונדס לפלוט אור ירוק רק כאשר הוא נקשר לסידן.
תְּמוּרָה מעגלית (Circular Permutation): ↑ שינוי צורתה של מולקולה תחת תנאים מסוימים.
הצהרת ניגוד אינטרסים
המחברים מצהירים כי המחקר נערך בהעדר כל קשר מסחרי או פיננסי שיכול להתפרש כניגוד אינטרסים פוטנציאלי.
הערת שוליים
1. ↑https://www.nobelprize.org/prizes/chemistry/2008/illustrated-information/
מקורות
[1] ↑ Sivadas, A., Broadie, K. 2020. How does my brain communicate with my body? Front. Young Minds 8:540970. doi: 10.3389/frym.2020.540970
[2] ↑ Lakowicz, J. R. 2006. Principles of Fluorescence Spectroscopy, 3rd Edn. Berlin: Springer.
[3] ↑ Heim, R., Cubitt, A. B., Tsien, R. Y. 1995. Improved green fluorescence. Nature. 373:663–4.
[4] ↑ Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., and Prasher, D. C. 2007. Green fluorescent protein as a marker gene expression. Tanpakushitsu Kakusan Koso Protein, Nucleic Acid, Enzyme. 52:1766–7. doi: 10.1126/science.8303295
[5] ↑ Shimomura, O., Johnson, F. H., and Saiga, Y. 1962. Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent. J. Cell. Comparat. Physiol. 59:223–39. doi: 10.1002/jcp.1030590302
[6] ↑ Nakai, J., Ohkura, M., and Imoto, K. 2001. A high signal-to-noise ca2+ probe composed of a single green fluorescent protein. Nat. Biotechnol. 19:137–41. doi: 10.1038/84397